Codice z06510

ACIDI FENILGLIOSSILICO  MANDELICO IPPURICO o-m-p-METILIPPURICO    URINARI
 in UV/Visibile

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Metodologia

Release N° 010

Giugno 2006

 

ACIDO FENILGLIOSSILICO / ACIDO MANDELICO / ACIDO IPPURICO /

ACIDI o-m-p-METILIPPURICI URINARI in UV

Codice Z06510

 

BIOCHIMICA

La determinazione dell’Acido Fenilgliossilico ( PGA ) e dell’Acido Mandelico ( MDA ) viene impiegata per il monitoraggio biologico dei soggetti esposti a Stirene.

Infatti lo Stirene viene trasformato dall’organismo dapprima in Stirene-ossido, quindi in Feniletilenglicole e successivamente in Acido Fenilgliossilico e Acido Mandelico (fig.1) i quali vengono eliminati immodificati.

Fig. 1 : Biotrasformazione dello stirene in vivo

La determinazione dell’Acido Ippurico ( HPA ) urinario viene impiegata per il monitoraggio biologico dei soggetti esposti a Toluene.

Infatti il Toluene viene trasformato dall’organismo prevalentemente in Acido Benzoico il quale, dopo coniugazione con Glicina, viene eliminato con le urine come Acido Ippurico. (fig.2).

Fig. 2 : Biotrasformazione del toluene in vivo

 

La determinazione degli Acidi o-m-p-MetilIppurici ( m-MHPA, o-MHPA e p-MHPA ) viene impiegata per il monitoraggio biologico dei soggetti esposti a miscele di o-m-p-Xilene.

Infatti lo Xilene, presente nei formulati commerciali come miscela dei tre isomeri o-m-p, viene trasformato dall’organismo in miscela di Acidi o-m-p-Metil-Benzoici i quali, dopo coniugazione con la Glicina, vengono eliminati come miscela di Acidi o-m-p-Metil-Ippurici con le urine. (fig. 2)

 

 

Fig. 3 : Biotrasformazione dello Xilene in vivo

 

 

 

 

CARATTERISTICHE DEL METODO

Principio del Metodo:

L’Acido Fenilgliossilico ( PGA ), l’Acido Mandelico ( MDA ), l’Acido Ippurico ( HPA ) e gli Acidi o-m-p-Metilippurici ( m-MHPA, o-MHPA e p-MHPA ) vengono analizzati previa diluizione con una soluzione diluente e successiva aggiunta di una soluzione stabilizzante. La soluzione così ottenuta viene iniettata direttamente in H.P.L.C.

Recupero del Metodo :

100%

Sensibilità del Metodo :

0,2 µg/ml

Ac. Fenilgliossilico

: < 5 mg / l

Ac. Mandelico

: < 5 mg / l

Ac. Ippurico

: < 1500 mg / l

Ac. o-m-p-MetilIppurici totali

: < 1 mg / l

Ac. Fenilgliossilico

: < 264 mg / l

Ac. Mandelico

: < 880 mg / l

Ac. Ippurico

: < 1600 mg / l
Ac. o-m-p-MetilIppurici totali

: < 1500 mg / l

Riferimento: G Ital Med Lav Erg 2002;24:3 Suppl

Range dinamico del metodo :

0,2 – 5.000 µg/ml

Contenuto della confezione :

Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a Temperatura Ambiente ( £ 20° C ). Il Calibratore è stabile 48 mesi a 2 – 8 °C.

Reagente A - Soluzione diluente, 1 x 200 ml

  

Reagente B - Soluzione Stabilizzante, 1 x 50 ml

  

Reagente C - Sol. Test, 1 x 10 ml

  

Reagente D - Sol. Test MDA e PGA, 1 x 10 ml

Reagente E - Sol. Test HPA, m-MHPA, o-MHPA e p-MHPA, 1 x 10 ml

 
Reagente F - Calibratore urinario liofilo, 1 x 5 ml

Vedi Avvertenze

Reagente M - Fase mobile, 2 x 500 ml

  

Dotazione strumentale minima richiesta :

Strumento H.P.L.C. isocratico con loop da 50 µl.

Detector spettrofotometrico UV/VIS l =207 nm

Registratore di cromatogrammi

Dotazione opzionale :

Autocampionatore.

Computer gestionale

Modalità per il prelievo urinario:

 All’inizio del turno lavorativo settimanale e alla fine del medesimo, è consigliato raccogliere 10 ml di urine in una provetta e inviarle al Laboratorio.

Fase preanalitica :

 Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti.

Stabile 4 settimane a 2- 8° C o 6 mesi a – 20 °C.

FASE PREANALITICA : Preparazione della Sol. Test.

 

In una provetta pipettare :

  • 990 m l di Acqua grado HPLC

  • 10 m l di Reagente C – Sol. Test

    • INIEZIONE :

  • Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo H.P.L.C ed attendere la stampa del cromatogramma.

    • Verificare che la Sol. Test abbia tempi di ritenzione simili a quelli riportati in fig. 4. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico.

    Importante : Questa Soluzione così ottenuta non deve essere usata come calibratore

     

     

    PROCEDURA ANALITICA:

     

    FASE 1 : Preparazione dei campioni

    In provette da centrifuga idonee dispensare in sequenza.

    Bianco

    Calibratore

    Campione
    Reagente A – Sol. diluente

    1,8 ml

    1,8 ml

    1,8 ml
    Reagente B – Sol. stabilizzante

    0,5 ml

    0,5 ml

    0,5 ml
    Acqua di grado HPLC

    0,02 ml

    		    
    Reagente F – Calibratore liofilo  

    0,02 ml

    		  
    Campione    

    0,02 ml

    Al vortex per 10 sec.

     

    FASE 2 : Centrifugare a 4.000 rpm per 5 minuti.

    N.B.: il campione così preparato è stabile 5 giorni a 2-8 °C

     

    INIEZIONE :

    • Iniettare 50 µl del sovranatante nel cromatografo H.P.L.C ed attendere la stampa del cromatogramma

     

     

     

    Acido FENILGLIOSSILICO / Acido MANDELICO / Acido IPPURICO /

    Acidi o-m-p-METILIPPURICI urinari in UV – Avvertenze

     

    REAGENTE C : SOLUZIONE TEST

    Acido Fenilgliossilico

    1000 mg / l
    Acido Mandelico

    1000 mg / l
    Acido Ippurico

    1000 mg / l
    Acido o-MetilIppurico

    1000 mg / l
    Acido m-MetilIppurico

    500 mg / l
    Acido p-MetilIppurico

    500 mg / l

     

    REAGENTE D : SOLUZIONE TEST Ac. Fenilgliossilico / Ac. Mandelico

    Acido Fenilgliossilico

    Circa 1000 mg / l
    Acido Mandelico

    Circa 1000 mg / l

     

    REAGENTE E : SOLUZIONE TEST Ac Ippurico, Acidi o-m-p-MetilIppurici

    Acido Ippurico

    Circa 1000 mg / l
    Acido o-MetilIppurico

    Circa 1000 mg / l
    Acido m-MetilIppurico

    Circa 500 mg / l
    Acido p-MetilIppurico

    Circa 500 mg / l

    REAGENTE F : CALIBRATORE URINARIO LIOFILO - Lotto n° ZUR527

    Acido Fenilgliossilico

    118 mg / l
    Acido Mandelico

    199 mg / l
    Acido Ippurico 1360 mg / l
    Acido o-Metil Ippurico

    55 mg / l
    Acidi m/p-Metil Ippurici

    112 mg / l

    Modalità d’uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. Aggiungere esattamente 5 ml di H2O di grado HPLC e agitare delicatamente per 15 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto.

    		  

    Conservazione e stabilità : i Calibratori liofili sono stabili 48 mesi dalla data di preparazione se conservati a 2 - 8° C. Almeno 12 ore a T Amb., 2 mesi se conservati a 2 - 8° C e 1 anno a -20° C una volta ricostituiti. Non usarli dopo la data di scadenza.

    		  

    Confezionamento : 1 x 5 ml

    		  

    Precauzioni : questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo.

    		  

     

    PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO

    l

    207 nm
    GAIN

    0,01 A.U.F.S.
    TEMPO DI INTEGRAZIONE

    10 secondi

     

    CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA

    Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H2O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H2O per HPLC, al flusso di 1,2 ml / minuto.

    Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml / minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. E’ possibile effettuare analisi a ricircolo di fase, purchè si abbia l’accortezza di filtrare la stessa Fase Mobile con filtro da 0,22 µ prima di ogni seduta analitica. Se la T Amb del Laboratorio è > 20°C si consiglia di conservare a 2-8°C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l’altra.

     

    PULIZIA DELLA COLONNA

    Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H2O e scaricare. Flussare una soluzione di H2O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H2O prima di condizionarla con la Fase Mobile.

     

    PARAMETRI HPLC

    LOOP

    50 µl
    Flusso di lavoro consigliato

    1,2 ml / minuto
    Pressione corrispondente

    Circa 80 bar

     

    PARAMETRI INTEGRATORE HP – 3394 / 3395 / 3396

    ATTENUAZIONE

    8

     

    PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE

    SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE

     

     

     

    Ac. FENILGLIOSSILICO, Ac. MANDELICO, Ac. IPPURICO e Acidi o-m-p-MetilIPPURICI urinari in UV

    ( Cromatogramma di riferimento )

     

     
    Fig. 5 : Calibratore
    R.T. 4.75 Ac. Fenilgliossilico 118 mg / l
    R.T. 7.24 Ac. Ippurico 1360 mg / l
    R.T. 8.37 Ac. Mandelico 199 mg / l
    R.T. 10.25 Ac. o-MetilIppurico 55 mg / l
    R.T. 17.69 Ac. p-MetilIppurico 56 mg / l
    R.T. 18.61 Ac. m-MetilIppurico 56 mg / l
    Fig. 4 : Soluzione Test
    R.T. 5.85 Ac. Fenilgliossilico 1000 mg / l
    R.T. 6.96 Ac. Ippurico 1000 mg / l
    R.T. 8.43 Ac. Mandelico 1000 mg / l
    R.T. 9.95 Ac. o-MetilIppurico 1000 mg / l
    R.T. 18.16 Ac. p-MetilIppurico 500 mg / l
    R.T. 19.26 Ac. m-MetilIppurico 500 mg / l

     

    Ac. FENILGLIOSSILICO, Ac. MANDELICO, Ac. IPPURICO e Acidi o-m-p-MetilIPPURICI urinari in UV

    ( Cromatogramma di riferimento)

     

    Fig. 6 : Controllo alto
    R.T. 4.82 Ac. Fenilgliossilico 177 mg / l
    R.T. 7.44 Ac. Ippurico 1742 mg / l
    R.T. 8.57 Ac. Mandelico 252 mg / l
    R.T. 10.55 Ac. o-MetilIppurico 76 mg / l
    R.T. 18.28 Ac. p-MetilIppurico 62 mg / l
    R.T. 19.24 Ac. m-MetilIppurico 67 mg / l
    Fig. 7 : Campione urinario
    R.T. 4.76 Ac. Fenilgliossilico 144 mg / l
    R.T. 7.24 Ac. Ippurico 1594 mg / l
    R.T. 8.38 Ac. Mandelico 236 mg / l
    R.T. 10.23 Ac. o-MetilIppurico 67 mg / l
    R.T. 17.68 Ac. p-MetilIppurico 55 mg / l
    R.T. 18.62 Ac. m-MetilIppurico 62 mg / l